Skip to content

Dwóch pacjentów z torbielowatą torbielą, mutacjami nonsensownymi w każdym gliwozie torbielowatym i łagodną chorobą płuc ad

4 miesiące ago

468 words

PCR przeprowadzono w objętości 100 .l zawierającej 500 do 1000 ng genomowego DNA, 2,5 jednostki polimerazy Taq (Cetus), 0,02 .mol każdego 5 -trifosforanu 2 -deoksynukleotydu (Pharmacia) i 2 .l 10 .M roztwór starterów 5 i 3 dla każdego eksonu w buforze polimerazy Taq (50 mM chlorek potasu, 10 mM TRIS, pH 8,3, 1,5 mM chlorek magnezu i 0,01 procent [wag./wag.] żelatyny). Genomowy DNA amplifikowano przez denaturację w 94 ° C przez 6 minut, a następnie 30 cykli obejmujących hybrydyzację w 58 ° C przez 30 sekund, wydłużenie w 72 ° C przez minutę, denaturację w 94 ° C przez 30 sekund, i końcowe wydłużanie w temperaturze 72 ° C przez 10 minut. Amplifikacja genomowego DNA ze starterami 20i-5 i 20i-3 wytwarza fragment 472 par zasad (bp), podczas gdy startery 21i-5 i 21i-3 wytwarzają fragment o długości 475 bp. Sekwencję nukleotydową każdego eksonu określono przez sekwencjonowanie DNA amplifikowanego za pomocą PCR z trzecim starterem wybranym z sekwencji intronowej 40 bp z miejsca składania 5 każdego eksonu. Sekwencjonujące startery 20s-5 (5 TAT-TTATGGCATGGTACC3 ) dla eksonu 20 i 21s-5 (5 TTAC-AATACAATAAGGGA3 ) dla eksonu 21 znakowano na końcach z [32P] ATP i kinazą T4, jak to opisano gdzie indziej.12 Direct sekwencjonowanie dwuniciowego DNA amplifikowanego przez PCR przeprowadzono jak opisano wcześniej.16, 17 Wykrywanie mutacji Exon 11
Opisane wcześniej mutacje nonsensowne, zastępujące glicynę w kodonie 542 (G542Stop) i argininę w kodonie 553 (R553Stop) wykryto w każdej rodzinie przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA zamplifikowanego przez PCR z egzonu 11 genu CFTR.13, 14 Obecność mutacji G542Stop została potwierdzona przez hybrydyzację oligonukleotydową specyficzną dla allelu, jak opisano w innym miejscu. [14] Mutacja R553Stop powoduje utratę miejsca HincII w eksonie 11.13. Brak trawienia amplifikowanego PCR DNA eksonu 11 za pomocą HincII potwierdziło obecność tej mutacji.
Wyniki
Figura 1. Figura 1. Sekwencjonowanie nukleotydowe amplifikowanego PCR genomowego DNA z Exons 20 i 21 z każdego genu CFTR z podkładkami 20s-5 i 21s-5, odpowiednio. Normalna sekwencja rozciągająca się od pozycji nukleotydowych 3887 do 3906 w eksonie 20 jest pokazana obok nieprawidłowej sekwencji u Pacjenta 271. Normalna sekwencja rozciągająca się od pozycji nukleotydowych 4065 do 4083 w eksonie 21 jest pokazana obok nienormalnej sekwencji w Pacjentu 246. Pacjent 271 miał Mutacja C-to-A w pozycji 3896 w jednym z genów mukowiscydozy, podczas gdy Pacjent 246 miał substytucję A dla G w pozycji 4079 w jednym z genów mukowiscydozy.
Rysunek 2. Rysunek 2. Wykrywanie mutacji bezsensownych w rodzinie (rodzina 76) pacjenta 271 (panel A) i analiza mutacji pacjenta 246 i jej rodziny (rodzina 68) (panel B). W panelu A matka pacjenta przenosi mutację nonsensownego eksonu G542Stop, jak pokazano przez hybrydyzację oligonukleotydu 542Stop z DNA amplifikowanym z eksonu 11. Trawienie DNA exon 20 amplifikowanego przez PCR z Hindlll ujawniło, że ojciec pacjenta ma 214 pz i 258 -bp fragmentów, co wskazuje, że jest heterozygotą pod względem mutacji S1255Stop.
W panelu B pacjentka i jej brat odziedziczyli mutację eksonów 11 R553Stop od swojej matki, co wykazała obecność fragmentu 425 bp po trawieniu HincII DNA eksonu 11
[więcej w: dyżury aptek stargard, zabieg wycięcia migdałków, psychoterapia zabrze ]

0 thoughts on “Dwóch pacjentów z torbielowatą torbielą, mutacjami nonsensownymi w każdym gliwozie torbielowatym i łagodną chorobą płuc ad”

  1. [..] odnosnik do informacji w naukowej publikacji odnosnie: firma cateringowa[…]